Si è trattato di uno studio epidemiologico di coorte, multicentrico che ha previsto di includere 1.149 bambini della scuola primaria di primo grado (età compresa tra 6 e 8 anni), residenti in 5 città italiane (Brescia, Lecce, Perugia, Pisa e Torino) caratterizzate da diversi livelli di inquinamento atmosferico (200 per ogni area).

Sono state effettuate le seguenti misurazioni per ogni area sede di reclutamento:

a) esposizione a inquinanti atmosferici:
- analisi chimiche sulla componente organica (IPA e nitroIPA) dei campioni di particolato fine (PM 0,5) dell’aria atmosferica raccolti mediante un campionatore ad alto volume;
- test di mutagenesi in vitro (test di Ames su batteri, Comet test e test dei micronuclei (MN) su linee cellulari polmonari) sui medesimi campioni;
- test di tossicità dei campioni di particolato fine (PM 0,5) dell’aria atmosferica su linee cellulari polmonari (A549) sui medesimi campioni;
- raccolta dati dei parametri chimici dell'aria urbana più comunemente rilevati dall'ARPA;

b) possibili fattori di interazione:
- somministrazione ai genitori dei bambini di un questionario concernente aspetti demografici e socio-economici, presenza di disturbi e malattie respiratorie, esposizioni ambientali indoor e outdoor, alimentazione, attività fisica ed altri aspetti dello stile di vita dei loro figli;

c) effetti biologici precoci:
- prelievo di un campione di cellule della mucosa orale con valutazione del danno al DNA mediante Comet test (protocollo a pH>13 e protocollo con per il danno ossidativo) e test dei MN.

Nessun tipo di indagine genetica è statta effettuata sulle cellule prelevate ai bambini.

Infine si è proceduto all'impiego di due modelli per il calcolo del rischio di effetti biologici precoci nei bambini. Il primo consiste in un programma di analisi impiegato per la valutazione dell'impatto sanitario da esposizione all'inquinamento (analisi di rischio) che porta a quantificare un eccesso di eventi indesiderabili, rispetto alla norma, correlabili con la situazione di esposizione ad una matrice ambientale contaminata.
Il confronto tra le stime del rischio di effetti cancerogeni prodotte dal modello e i risultati dei test di danno al DNA sulle cellule della mucosa orale hanno permesso di valutare la bontà del modello per la predizione di effetti biologici nei bambini. Inoltre, si è proceduto alla costruzione, in via sperimentale, di un modello globale per il calcolo del rischio di avere un effetto biologico precoce da esposizione a inquinanti atmosferici, che includa non solo le variabili ambientali, ma anche gli altri fattori presi in esame.

Dimensione del campione. La numerosità dei bambini da reclutare nelle 5 città è stata determinata per poter osservare differenze significative nei parametri considerati (danno al DNA e MN in cellule della mucosa orale) tra i bambini residenti nelle aree a maggiore esposizione a inquinanti atmosferici e quelli residenti in aree a livello inferiore di inquinamento. Sulla base di alcuni studi recenti ci si poteva aspettare di rilevare con il Comet test un danno al DNA, espresso come percentuale di DNA migrato nella coda della cometa (tail intensity, TI) di circa 10%, in media, nei soggetti a maggiore esposizione vs 7% in quelli a minore esposizione, con una deviazione standard massima di 10%. Il campione di bambini inclusi nella ricerca è stato dicotomizzato sulla base della mediana della distribuzione dei parametri di qualità dell’aria considerati.
Assumendo una distribuzione log-normale della variabile in studio, si stimava di osservare una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi, al di sopra e al di sotto della mediana, rispettivamente, con un errore alfa di 0,05 e una potenza superiore al 95% effettuando un test t di Student per gruppi indipendenti a due code.

Periodo di reclutamento. Da settembre 2014 al marzo 2016. Per analizzare la possibile relazione dose-effetto tra esposizione a inquinanti ed effetti biologici i campioni di aria e i campioni biologici sono stati raccolti negli stessi bambini e nelle stesse aree in momenti caratterizzati da livelli di inquinamento atmosferico differenti: la stagione invernale 2014-2015 e la tarda primavera del 2015. Inoltre, per valutare la variabilità biologica intra-soggetto, sui soli bambini reclutati a Brescia è stato effettuato un terzo prelievo di materiale biologico nella successiva stagione invernale (2015- 2016), a distanza di un anno dal primo.

Reclutamento. In ogni città, sono state individuate 2 o 3 scuole situate in diverse zone del territorio cittadino; sono stati presi i contatti con la dirigenza scolastica e gli insegnanti, con l’aiuto dei quali si sono organizzati incontri con i genitori degli alunni, per illustrare il progetto e invitare alla partecipazione. Nella ricerca sono stati inclusi circa 250 bambini di età compresa tra i 6 e gli 8 anni in ogni città, per un totale di 1.149 bambini reclutati nell’intero studio. Sono stati esclusi i bambini con patologie gravi e/o sottoposti negli ultimi 12 mesi a radioterapia, chemioterapia, esami radiografici e che usano apparecchi ortodontici. Per partecipare allo studio è stato raccolto il consenso informato da parte dei genitori ai quali sarà somministrato il questionario. E' stata garantita la riservatezza dei dati raccolti che sono stati trattati ai sensi delle normative vigenti (privacy).

Aspetti etici. Il progetto è stato sottoposto, per l'approvazione, al parere del Comitato Etico a all’ASL della Provincia di Brescia, competenti per l’area cui afferisce il responsabile della ricerca (Brescia) e successivamente in ciascuna delle altre 4 città (Lecce, Perugia, Pisa e Torino) in cui è stato effettuato il reclutamento dei bambini. E' stata fornita ai genitori l’informativa dello studio e raccolto il consenso al trattamento dei dati personali, firmato dai genitori dei bambini ed il modulo di assenso del minore alla partecipazione allo studio. Tutti i dati sono stati raccolti ed analizzati secondo quanto disciplinato dal Decreto Legislativo n. 196 del 30/6/2003 "Codice in materia di protezione dei dati personali” e successive integrazioni, per gli scopi della ricerca.