Questionario. E' stato utilizzato un questionario ad hoc per raccogliere informazioni sull'esposizione ambientale outdoor e indoor, altezza e peso, alimentazione, attività fisica ed altri aspetti dello stile di vita dei bambini.

Prelievo del campione biologico. Per la raccolta delle cellule della mucosa orale, è stato chiesto ai bambini di sciacquare due volte la bocca con una soluzione salina in modo da ottenere i leucociti da destinare al Comet test. Successivamente, le cellule epiteliali della mucosa orale, da destinare al test del micronucleo (MN), sono state prelevate mediante spazzolamento dell’interno della guancia con uno spazzolino. Questo metodo di campionamento è stato semplice e non invasivo e quindi accettabile sia dai bambini sia dai genitori.
Il Comet test e il test dei MN sulle cellule della mucosa orale devono essere effettuati su materiale fresco per evitare il deterioramento delle cellule. 

Comet test. Il Comet test sui leucociti della bocca è stata condotta in accordo con il metodo di Singh (A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exper Cell Res. 1988;175:184-191).

Test del micronucleo. Le cellule della mucosa orale sono state trattate secondo il metodo di Thomas (Buccal micronucleus cytome assay. Nat Protoc. 2009;4(6):825-837).

Prelievo dei campioni ambientali. Al fine di valutare la qualità dell'aria di tutte le città coinvolte nella ricerca, un campionatore ad alto volume,  è stato posizionato nei pressi delle scuole in cui saranno reclutati bambini e raccoglierà il PM 0,5 su membrane in fibra di vetro, per 72 ore, nei medesimi giorni in cui vengono effettuati i prelievi di cellule della mucosa orale. Tutte le membrane, dopo la determinazione gravimetrica, sono state inviate all'Unità di Brescia, dove, mediante estrazione organica, sono stati preparati i campioni per le analisi chimiche e di mutagenesi in vitro.

Analisi chimica. E' stata determinata la concentrazione di IPA e nitroIPA, composti ad attività mutagena e quindi potenzialmente correlabili col danno genotossico evidenziato nei test di mutagenesi in vitro sull'aria e nei test in vivo nei bambini. 

Test di Ames. Sugli estratti organici del PM 0,5 raccolto nelle diverse città è stato condotto, il test di Ames, secondo la metodica di Maron e Ames (Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mut Res. 1983;113: 173-215).

Comet test in cellule A549. Un’aliquota dell’estratto organico del PM 0,5 raccolto nelle diverse città è stato inviato all’Università di Torino dove è stato condotto il Comet test su cellule umane dell'apparato respiratorio (linea cellulare A549) in accordo con il metodo di Singh et al. (A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exper Cell Res. 1988;175:184-191).

Test del micronucleo in cellule A549. Un’aliquota dell’estratto organico del PM 0,5 raccolto nelle diverse città, è stato inviato all’Università di Perugia dove è stato analizzato utilizzando il test del micronucleo su cellule della linea A549 secondo il metodo di Fenech (The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. 2000;455:81–95).

Test di tossicità in cellule A549 e HFBE2. Sugli estratti organici del PM 0,5 raccolto nelle diverse città, sono stati condotti test di tossicità su due diverse linee cellulari umane (bronchiali e alveolari) per valutare la proliferazione, la vitalità cellulare e gli eventuali effetti sulla comunicazione intercellulare.

Acquisizione dati dei parametri chimici dell'aria misurati di routine. Sono stati raccolti i dati dell'ARPA sui principali parametri della qualità dell'aria misurati di routine (CO, NO₂, SO₂, benzene, O₃, PM 10, PM 2,5) relativi ai periodi di campionamento.

Data management, analisi di tutti i dati e costruzione di modelli di rischio

Data management. E' stato predisposto un unico database informatizzato per il caricamento di tutti i dati raccolti nello studio, anonimi e provvisti di un codice identificativo univoco alfanumerico attribuito a ciascun bambino reclutato; un secondo file contiene solo l’anagrafica dei bambini e il corrispondente codice identificativo. Entrambi i file sono protetti da password, note ai soli ricercatori e custodite nella documentazione dello studio.

Analisi di rischio e validazione. E' stataeffettuata, in collaborazione con l’Università di Lecce, l'analisi di rischio per la valutazione dell'impatto sanitario da esposizione all'inquinamento, utilizzando un modello che stima quantitativamente il rischio cancerogeno da esposizione ad aria inquinata utilizzando sia parametri standard (PM 10, PM 2,5, NOx, e altri) sia quelli investigati nella ricerca (IPA e nitroIPA). Il confronto tra le stime di rischio di effetti cancerogeni prodotte dal modello (valore “atteso”) e i risultati dei test di danno al DNA sulle cellule della mucosa orale (valore “osservato”) hanno consentito di valutare la bontà del modello per la predizione di effetti biologici nei
bambini.

Analisi statistica e costruzione di un modello globale per il calcolo del rischio. Le differenze degli indicatori di effetto biologico nei bambini a maggiore e minore esposizione agli inquinanti atmosferici tradizionali e quelli oggetto della ricerca, è stato effettuato in primo luogo mediante i test, parametrici e non parametrici, di più comune impiego per il confronto tra distribuzioni, medie e proporzioni. Inoltre, verranno utilizzati metodi di analisi multivariata per valutare l’associazione tra indicatori di effetto e parametri ambientali, tenuto conto di eventuali confondenti. In particolare, la relazione dose-effetto tra esposizione a inquinanti atmosferici, mutagenicità dell'aria ed effetti biologici precoci sarà valutata mediante modelli di regressione. Nel solo campione di bambini di Brescia, è stata valutata la stabilità temporale dei marcatori d'effetto biologico precoce mediante il confronto dei test eseguiti, sugli stessi bambini, in due anni successivi, nella stagione invernale.
L'analisi dei questionari alimentari è stata condotta in modo da costruire pattern alimentari compositi.
E' quindi valutato il ruolo di fattori di interazione nella relazione tra esposizione a inquinanti ed effetti biologici mediante analisi stratificate e modelli statistici. Si è proceduto poi alla costruzione, in via sperimentale, di un modello globale per il calcolo del rischio di avere un danno biologico precoce da esposizione a inquinanti atmosferici che includa non solo le variabili ambientali ma anche gli altri fattori presi in considerazione (inquinamento atmosferico, esposizioni indoor, alimentazione, attività fisica, indice di massa corporea e altre variabili legate allo stile di vita).